AFDye 555 NHS ester 

 (Alexa Fluor 555 NHS ester Equivalent) 

產品信息

產品描述

AFDye 555是一種水溶性、強光穩(wěn)定性的染料，具非常高的光量子產量。AFDye 555是一種發(fā)橙色熒光的染料，可使用488nm或532nm激光譜線進行激發(fā)。是Cy3或四甲基羅丹明的替代品，在活細胞和固定細胞中的光穩(wěn)定性優(yōu)于Cy3。在pH 4-10范圍內耐受性強。

AFDye555 NHS ester (Equivalent toAlexa Fluor 555 NHS ester）是一種胺反應、發(fā)橙色熒光的染料，通常通過伯胺來標記蛋白或抗體、多肽、胺基修飾的寡核苷酸，以及其它含胺基生物分子。這一標記通常在pH 7-9范圍zui有效，形成穩(wěn)定和共價酰胺鍵。

產品特性

保存與運輸方法

保存：-20oC避光干燥保存，2年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2） AFDye NHS ester系列染料雖有一定的水溶性，但，強烈推薦用DMSO、DMF溶解配制母液，再進行后續(xù)的標記實驗。因為，在水溶性體系中這些反應性基團非常容易被水解生成非反應性的游離酸形式。

3） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

一、染色步驟（以免疫球蛋白IgG的標記為例）

幾乎所有蛋白或多肽都能用胺反應試劑（探針）來標記。以下是針對IgG抗體而優(yōu)化的標記步驟，用戶可根據自身蛋白量來放大或縮小反應體系，但為了得到理想的染色結果，蛋白濃度不得小于2mg/ml。由于不同蛋白（多肽）所含胺基數目、胺基表面位置都有巨大差別，建議用戶在初次實驗時，建立三組不同的胺反應試劑：蛋白的摩爾比，以篩選出能達到zuijia標記效率的摩爾比。

1.1 于1ml 0.1M碳suan氫鈉緩沖液充分溶解~10mg蛋白。

注① ：蛋白濃度通常為5-20mg/ml，偶聯的成功率對蛋白濃度具高度依賴性。當濃度低于2 mg/ml，會嚴重影響標記效率。

注② ：標記體系應避免任何含胺基底物，如Tris、glycine、銨鹽、或其他穩(wěn)定蛋白如BSA等，如待標記的蛋白溶液中含有上述物質的污染，則需透析到10-20 mM的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，再向每ml蛋白溶液中加入0.1 ml 1M碳酸氫鹽緩沖液（pH 8.3–9.0）調至所需pH值。

注③ ：抗體溶液中存在的低濃度疊氮鈉（＜3 mM）或硫汞撒（＜1 mM）不會干擾標記反應。

1.2 用高質量無水DMF或DMSO溶解胺反應試劑（探針）（比如：AFDye555 NHS ester）至10 mg/ml。

注①：AFDye 488 NHS ester的水溶液務必現配現用，不可保存，因其在水溶液中，會被水解成非活性游離酸。AFDye 488 NHS ester的DMSO儲存液可置于≤-20℃保存，建議2周內用完。

1.3 一邊攪拌或渦旋蛋白溶液，一邊緩慢加入50-100 µl 胺反應試劑（探針）。

注①：加入胺反應試劑（探針）的量在0.5-1 mg，總的來說，約1/4-1/3的胺反應試劑會偶聯到蛋白上。不同的蛋白和標記試劑的標記效果不同，請根據具體情況優(yōu)化兩者比例。

1.4于室溫緩慢攪拌避光孵育1h（或更長）。

1.5【可選】通過加0.1ml新鮮配制的1.5M羥胺（pH 8.5）來終止反應，于室溫孵育含羥胺體系1h。

1.6純化：選擇一種合適的方式（比如：透析法、P-30柱子或PD-10柱）來純化標記產物，去除鹽離子或未反應的胺反應試劑。

1.7貯存：標記好的蛋白避光保存于2-8℃。若純化的蛋白偶聯物濃度＜1mg/ml，加入BSA或其它穩(wěn)定蛋白1-10mg/ml。在2mM疊氮鈉存在的情況下，2-8℃可保存幾個月。若需保存更長時間，需分裝后于-20℃避光保存，避免反復凍融。

二、計算標記比例（F/P值）

對于免疫球蛋白IgG等大多數抗體來說，摩爾吸光系數為203000，F/P值在4～9之間是最合適。
2.1AFDye555標記蛋白F/P值計算：
1）用PBS精確倍數稀釋定量的少許純化過的偶聯蛋白，在1cm比色皿中測定280nm和555nm的光吸收；
2）計算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A555×0.08))×稀釋倍數/203000
3）計算標記比例：每摩爾蛋白結合的染料摩爾數=A555×稀釋倍數/(150000×蛋白摩爾濃度)

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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