Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF568-conjugated重組霍亂毒素B亞基（CF568標(biāo)記，紅色熒光）

產(chǎn)品信息

背景描述

霍亂毒素（Cholera toxin，CTX）是霍亂弧菌產(chǎn)生的毒力因子，會(huì)引起嚴(yán)重腹瀉以及人體脫水。CTX屬于AB5亞基家族。天然六聚體蛋白含兩個(gè)亞基，分子量約85kDa。由一個(gè)A亞基（約27.2kDa）和五個(gè)B亞基（約11.6kDa/亞基）組成，B亞基以五聚體環(huán)的方式排列，呈明顯的五度對(duì)稱，負(fù)責(zé)毒素識(shí)別并吸附細(xì)胞表面的神jing節(jié)苷脂GM1。

A亞基催化刺激性G蛋白α亞基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亞基。Gαs的活化引起腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性增加，進(jìn)而促使cAMP水平提高。A亞基還能ADP核糖基化視桿細(xì)胞外節(jié)膜盤(pán)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使得GTPase失活。霍亂毒素還是一種高效的黏膜疫苗佐劑，通過(guò)抑制IL-12生產(chǎn)來(lái)誘導(dǎo)2型輔助性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

霍亂毒素B亞基（CTB）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，本質(zhì)上不含腺苷酸環(huán)化酶活性。CTB通過(guò)結(jié)合神jing節(jié)苷脂GM1附著到細(xì)胞上，是小膠質(zhì)細(xì)胞的良好標(biāo)記物（這類細(xì)胞表面富含神jing節(jié)苷脂GM1），但不適合標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞。

CTB是利用組化方法研究軸突運(yùn)輸?shù)膬?yōu)秀示蹤劑。CTB也是常用的脂筏標(biāo)記物，脂筏是富含膽gu醇和鞘脂的膜微區(qū)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。

產(chǎn)品描述

本品是偶聯(lián)上紅色熒光素-CF568（Ex/Em=562/583 nm）的重組霍亂毒素B亞基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF568-conjugated，簡(jiǎn)寫(xiě)：CF568 conjugated- rCTB，適用于神經(jīng)學(xué)研究中的束路追蹤，靶向神jing節(jié)苷脂GM1）結(jié)合和逆行運(yùn)輸。也可在活細(xì)胞或固定細(xì)胞成像中用作脂筏標(biāo)記物和內(nèi)吞示蹤劑。

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃保存，至少6個(gè)月有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 本品以凍干粉形式提供，由于量比較少，初次使用前需置于室溫回溫至少30min，低速離心后，再開(kāi)蓋直接往瓶?jī)?nèi)加入合適的溶劑進(jìn)行溶解。

2） CF系列熒光染料是Biotium的注冊(cè)商標(biāo)，Alexa Fluor和DyLight系列染料是Thermo Fisher的注冊(cè)商標(biāo)，Cy系列染料是Cytiva的注冊(cè)商標(biāo)。

3） 本品僅供科研用途，絕不可以用于臨床或診療用途。

4） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

以下是用熒光標(biāo)記的rCTB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)流程。對(duì)于其他的應(yīng)用（比如：神經(jīng)示蹤），請(qǐng)根據(jù)應(yīng)用查找相應(yīng)的文獻(xiàn)作為參考。

一、 自行準(zhǔn)備材料

1.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）（比如：MS3552-500ML）

1.2 牛血清白蛋白（BSA）（比如：MP6101-5G）

1.3 HBSS（比如：MS3505-500ML）

1.4 4%多聚甲醛（比如：MM1504-500ML）

1.5 【可選】Hoehcst 33342（比如：MX4203-10MG，MX4203-1ML，MX4204-10ML）

二、 染料準(zhǔn)備

重溶：將低溫保存的CF568 conjugated- rCTB（規(guī)格：100μg）置于室溫回溫至少30min，低速離心3-5min，將粉末離心至管底。直接往瓶子加入100μl無(wú)菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。

保存：新鮮制備的CF568 conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3個(gè)月穩(wěn)定。亦可根據(jù)單次用量分裝后，置于-20℃避光保存，6個(gè)月穩(wěn)定，避免反復(fù)凍融。

三、 活細(xì)胞的表面標(biāo)記

3.1用4℃預(yù)冷的HBSS+0.5% BSA清洗細(xì)胞一次；

3.2用4℃預(yù)冷的HBSS+0.5% BSA稀釋CF568 conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作濃度：400ng/ml-1μg/ml。

3.3吸走細(xì)胞內(nèi)的緩沖液，加入新鮮配置的CF568 conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。

3.4用4℃預(yù)冷的HBSS+0.5% BSA清洗細(xì)胞三次；

3.5用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，+4℃避光固定15min。

3.6用PBS清洗細(xì)胞二次，之后進(jìn)行成像或接著做后續(xù)的染色。【注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，考慮是否加入核復(fù)染劑-Hoechst 33342等】

應(yīng)用實(shí)例（來(lái)自文獻(xiàn)，僅做參考）

Ref1）Uddin O, Anderson M, Smith J, Masri R, Keller A. Parabrachial complex processes dura inputs through a direct trigeminal ganglion-to-parabrachial connection. Neurobiol Pain. 2021 Jan 21;9:100060. doi: 10.1016/j.ynpai.2021.100060. PMID: 33537510; PMCID: PMC7840999.

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模航馄首粉櫍ˋnatomical tracing）

實(shí)驗(yàn)方法：We used a glass pipette with a 40 µm tip to pressure inject (Nanoliter 2010 pump, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 500 nL (50 nl/min) of CF568-conjugated cholera toxin B (CF568 conjugated CTB;) into PB unilaterally (right side). We made a craniotomy over the right middle meningeal artery and carefully exposed the dura, applying 5 µl of Fluorogold (Hydroxystilbamine) to the area, diluted to 5% in sterile saline, using a sterile pipette tip. We covered the dura application site with sterile Gelfoam and closed the incision with nylon suture. One week after tracer application we deeply anesthetized the rat with urethane and performed a transcardial perfusion with 0.05M PBS followed by 4% PFA.

實(shí)驗(yàn)圖片：

Fig.Dura afferents project directly to PB. (A) A map of the injection site cores, depicted by black outlines. (B) The diagram depicts the experimental setup. CTB labels PB-projecting TG neurons and Fluorogold labels dura-innervating TG neurons. (C) Examples of dual-labeled neurons are representative images from 3 different animals–arrows denote double labeled cells. The green arrows indicate Fluorogold labeling and the red arrows indicate CTB labeling. Confocal images are shown in their native grayscale format.

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附錄I幾款CF染料的光譜特征

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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